犬副流感病毒有单克隆抗体吗？犬瘟热病毒在圈养西伯利亚虎和小熊猫中的暴发和基因分型

文丨纪实册编辑丨纪实册

这项研究，在中国广东省的一个动物园发生的两次单独的CDV暴发期间，从圈养的西伯利亚虎和小熊猫中分离出四种犬瘟热病毒株。基于全长血凝素和融合基因的序列比对和系统发育分析表明，它们与基因型Asia-1非常相似。

在确认西伯利亚虎感染CDV之前，为了控制疾病的传播，几乎所有食肉动物都使用了减毒活组合CDV疫苗，除了小熊猫，其中使用了另一种重组组合CDV疫苗。然而，大约两个月后，CDV再次出现，并导致小熊猫死亡。

根据疫苗接种记录，活组合疫苗可以被认为是动物园食肉动物对抗CDV的理想武器。虽然重组组合CDV疫苗对小熊猫是安全的，但其保护效果仍有待进一步研究。

根据爆发间隔时间和序列特征，我们怀疑动物园内流通的流浪猫是中间宿主，这有助于CDV从流浪狗传播到动物园动物，这项研究揭示了疫苗接种和生物安全对动物园动物的重要性。

犬瘟热病毒是一种小包膜病毒，含有大小约 15.7 kb 的单链负义 RNA 分子。CDV属于副粘病毒科，按麻疹病毒顺序排列 1.CDV的宿主范围很广，包括熊科、犬科、原花青科、海蝇科、猫科和鼬科。

随着生态环境的变化和CDV对动物流行病因素的适应，加上CDV变异株的出现，CDV具有新的不常见宿主，其中包括非人灵长类动物、非食肉动物物种和海洋哺乳动物，犬瘟热是感染CDV的动物的“毁灭性传染病”。

具有多种临床症状，包括打喷嚏，咳嗽，流鼻涕，发烧，嗜睡，呕吐，腹泻，食欲不振。而且，受影响的动物容易被其他病原微生物感染，使CD的死亡率高达80%。最近，有许多关于野生老虎和动物园老虎中CDV的报道，CDV感染也导致大熊猫患病和死亡。

在研究中，中国广东省的一个动物园中出现了圈养的东北虎和小熊猫中的两次不连续的CDV暴发。除此之外，对全长H和F基因序列及其相应的氨基酸序列进行了表征和分析。基于CDV的暴发情况，在动物园讨论了CDV可能的病毒来源和未来的控制措施。

CDV 确认和控制

根据临床表现，CDV在疾病暴发期间被认为是疑似病原体。对东北虎和小熊猫的肺和肾样本进行研磨和过滤。使用上清液接种Vero细胞，在第 3 代中，观察到明显的细胞病变效应。

因此分离出09株CDV病毒，分别命名为东北虎GZZ1101中国、小熊猫/GZZ1102/中国、小熊猫/GZZ1103/中国和小熊猫/GZZ<>/中国。

除此之外，它们通过PCR方法进一步确认。在确认西伯利亚虎感染CDV之前，为了控制疾病在动物园动物中的传播，除小熊猫使用不同的重组组合CDV疫苗外，几乎所有食肉动物都使用了一种减毒活组合CDV疫苗。

然而，CDV仅在大约两个月后才在小熊猫中重新出现。

CDVH、F基因的序列表征

为了表征1824株CDV菌株，获得了它们的H基因全长序列。H基因由607个核苷酸组成，编码99个氨基酸。有趣的是，他们具有相同的预测H蛋白序列，178038种染色的H基因序列分别与386683株大熊猫源菌株和5株虎源菌株表现出较高的核苷酸相似度。

然而，它们与疫苗株明显不同。在氨基酸水平上，它们与原型毒力菌株A75/17相同，92.2%~92.6%为经典疫苗株，91.9%~92.9%为其他疫苗株。虽然与其他亚洲-96基因型菌株相比，它们与其他亚洲-1基因型菌株的相似性要高得多。

但它们在549和75的位置有所不同。目前四种菌株的SLAM受体氨基酸结合位点，与几种野生分离株相同，包括同一区域的A17/001863、一种猞猁来源菌株和一种犬源菌株，此外，它们有<>个潜在的糖基化位点，与CDV菌株的其他基因型不同。

现有1989株CDV株的F基因序列长度相同，与狗、狐狸、浣熊和水貂分离的GZ0803、GZ0804、HeB（07）1、河北分离株核苷酸同一性较高，在氨基酸水平上，它们对野生菌株的同一性略高于A17/93、Onderstepoort疫苗株和其他疫苗株。

F蛋白的氨基酸在CDV基因组中变化最大24并与地理分布相关，在这项研究中，结果表明，目前菌株的前肽区域彼此几乎相同，但与其他Asia-93菌株分别仅共享3.97-5.85%的核苷酸和9.96-3.1%的氨基酸同一性。

特别是，在核苷酸水平和氨基酸水平上，与Onderstepoort疫苗株的同一性分别低至81%和63.7%。

CDVH、F基因的系统发育分析

为了确定这些CDV的遗传关系，进行了基于H和F基因序列的系统发育分析。结果显示，东北虎/GZZ09/中国、小熊猫/GZZ1101/中国、小熊猫/GZZ1102/中国和小熊猫/GZZ1103/中国被归类为与当前大流行基因型对应的亚洲-1基因型。

与亚洲-2、亚洲-3和其他基因型存在显著差异。此外，在Asia-1基因型中形成了一个小的亚基因型分支，主要由最近发现的菌株引起。

H 和 F 蛋白的高级结构分析

预测了H和F蛋白的高级结构谱。对于H蛋白，西伯利亚虎源CDV菌株和小熊猫源CDV菌株之间存在两个主要差异，其结构特征分别与Onderstepoort，CDV3，Convac和Recombinant Snyder Hill相似。

然而，对于F蛋白，与CDV疫苗株相比，西伯利亚虎源和小熊猫源的CDV株具有特定的结构特征。

在过去的几年中，世界上约有500只野生东北虎，主要分布在俄罗斯远和中国东北部，由于人口扩张、非法狩猎和环境变化，东北虎很少在野外被发现。

野生小熊猫只剩下不到10， 000只。目前，东北虎和小熊猫已被列为濒危物种。他们经常被囚禁在动物园或野生动物救援站，以扩大人口数量。在这种情况下，它们被认为是具有足够食物且没有天敌的特殊动物。

然而，包括CD在内的一些严重瘟疫经常威胁他们的生命，俄罗斯野生西伯利亚虎中CDV暴发的数量有所增加，导致野生西伯利亚虎种群减少票价19 元。

在这项研究中，我们报道了圈养的西伯利亚虎和小熊猫，由于中国野生型CDV毒株的感染而死亡，这表明CDV对动物园动物构成重大威胁。

我国有各种针对克罗恩病的CDV疫苗。其中大多数用于狗，只有两种疫苗用于养殖毛皮动物，接种疫苗是控制狗克罗恩病的有效方法，然而，对于濒危动物，动物园老板对使用减毒活的犬源性疫苗相当谨慎。

一项研究表明，一种减毒活联合疫苗对动物园大型猫科动物，包括西伯利亚虎，非洲狮和欧亚猞猁是安全有效的;而白虎接种疫苗后不能产生CDV中和抗体。Onderstepoort疫苗株诱发的犬瘟热在小熊猫中报道。

直到最近爆发，CDV疫苗才用于动物园的紧急疫苗接种。考虑到疫苗株的毒力残留，引入重组组合CDV疫苗并将其用于小熊猫，与动物园食肉动物使用的活组合CDV疫苗相比，重组CDV疫苗对小熊猫是安全的。

但其保护效果仍不得而知。实际上，发现重组金丝雀痘载体CDV疫苗在接种疫苗后66天，仅在较少的圈养老虎中诱导低水平的中和抗体，表明重组CDV疫苗不是紧急疫苗接种的好选择。

在一定程度上，本研究中CDV在小熊猫中与重组CDV疫苗一起重新出现证实了这一理论。尽管本毒株H和F蛋白的序列特征和高级结构图谱与活疫苗株不同，但该疫苗对除小熊猫以外的动物园食肉动物具有良好的应急预防效果。

这表明Onderstepoort菌株可以为大多数食肉动物提供足够的保护。但是，对于包括小熊猫和白虎在内的濒危动物物种，有必要开发有效且具有物种特异性的CDV疫苗，并评估相应的疫苗接种策略。

目前，尽管有CDV疫苗，但由于成本高，保护期短，许多地方，特别是经济欠发达国家和地区，疫苗接种并不常规。在中国，伴侣犬、流浪狗和食肉动物数量众多，中国政府和兽医从业人员在控制CD方面仍面临相当大的挑战。

研究表明，动物园爆发中CDV的可能来源是小型食肉动物，它们可能与圈养猫接触。CDV通过气溶胶飞沫和接触受感染动物的分泌物传播，本研究中提到的动物园位于市中心，每天都接待许多游客。

这些缺乏疫苗接种的流浪动物可能对驯养宠物、动物园动物甚至人类的健康构成严重威胁。CDV可以感染家养猫，而不会导致受感染猫的重大临床疾病和死亡，在这项研究中，东北虎的生活区靠近市中心的街道，流浪狗和猫在那里自由奔跑，流浪狗无法进入动物园。

但是，具有良好攀爬能力的流浪猫可以自由进入动物园。因此，根据两次暴发的间隔时间，我们怀疑动物园内流通的流浪猫是中间宿主，它们促成了CDV从流浪狗传播到动物园动物。

在线Blastn结果显示，目前80个CDV F基因序列与源自同一地点的一个犬源CDV序列的相似度最高。这一信息进一步支持，目前疫情中CDV的可能来源是流浪狗或宠物狗。

动物园应建造一些封闭的生活区，为易感动物提供观景平台，以避免与流浪猫接触。此外，动物园应加强对游客和动物饲养员的管理。

综上所述，本研究报道了中国南方广东省动物园圈养的东北虎和小熊猫中CDV的暴发，进一步揭示了常规疫苗免疫和生物安全对动物园动物的重要性。

广东省某动物园内一只亚成年东北虎出现精神抑郁、共济失调、腹泻，伴有呼吸道疾病的临床症状（包括咳嗽和眼鼻粘稠），最终死亡。

犬瘟热病毒被怀疑是疫情的病原体。为了防止疾病的传播，在除小熊猫以外的所有食肉动物中，使用减毒活组合CDV疫苗进行了紧急疫苗接种。

小熊猫接种了另一种联合疫苗，该疫苗含有表达CDV，改良活犬腺病毒200型和犬细小病毒的HA和F糖蛋白的重组金丝雀痘载体的冻干悬浮液。不幸的是，大约两个月后，五只小熊猫也因可疑的CDV感染而相继死亡。

生长Vero细胞在Dulbecco的改良鹰培养基中补充了10%的热灭活胎牛血清，FBS，生命技术公司的Gibco，50 U / ml青霉素和50μg / ml链霉素。然后，用组织滤液接种Vero细胞并孵育直至观察到细胞病变效应。

病毒RNA提取和RT-PCR检测

使用E.Z.N从细胞上清液中提取病毒RNA。使用TaKaRa RNA LA PCR试剂盒Ver，在1°C下进行病毒RNA迷你试剂盒和逆转录，在30°C下进行10分钟，42°C30分钟，70°C15分钟和5°C5分钟。

使用一组靶向部分H基因的引物进行PCR检测，PCR反应条件如下：94°C5分钟，扩增30个循环（94°C变性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸1分钟），最终延伸72°C15分钟。预期产品规模为587 bp。

CDV完整H和F基因的扩增，为了进一步表征这些CDV菌株，分别使用两对PCR引物扩增其完整的H和F基因序列38、39 .RT过程与上述相同。H基因的PCR反应条件如下：94°C10分钟，扩增35个循环，72°C最终延伸10分钟。

F基因的PCR反应条件为：94°C10分钟，扩增35个循环，最终在72°C延伸10分钟。 将PCR产物克隆到pMD18-T载体中，使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化阳性重组质粒，并通过桑格测序法进行测序。

基因序列由SeqMan程序拼接。CDV的897605个H和897612个F基因序列被提交到GenBank数据库中。通过MEGAlign比较核苷酸和氨基酸序列，基于H和F基因的系统发育树（表S000）采用MEGA 5.1软件中实现的邻域连接方法构建，使用NetNGlyc 0.32服务器分析了H蛋白的N-糖基化位点。

结论

根据疫苗接种记录，活组合疫苗可以被认为是动物园食肉动物对抗CDV的理想武器。虽然重组组合CDV疫苗对小熊猫是安全的，但其保护效果仍有待进一步研究

根据爆发间隔时间和序列特征，发现动物园内流通的流浪猫是中间宿主，这有助于CDV从流浪狗传播到动物园动物。这项研究揭示了疫苗接种和生物安全对动物园动物的重要性。

参考文献

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