射线检测工艺主要控制参数：通过汉驰反应高通量制备放射防护聚合物

前言：

汉驰反应是一种用于高通量制备放射防护聚合物的方法，该反应可以在相对较短的时间内合成大量的聚合物，并具有辐射防护性能，研究中，通过汉驰反应以HTP方式高效合成了单体库，产量很高，这些单体已被用于通过HTP与水溶性单体共聚来构建水溶性聚合物库。

通过HTP测量筛选这些聚合物，以获得具有最佳抗辐射能力的生物相容性聚合物，在细胞和体内实验中，这种选定的聚合物有效地保护细胞和斑马鱼胚胎免受致命剂量的电离辐射（80 GyX射线）的伤害。

抗激素检测

在96孔板中，将磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液（pH ~ 7.4）的水杨酸（20 μL，10 mM）、FeSO4（20 微升，10 毫米M）、H2O2（20 μL，10 mM）和聚合物（100 μL，10 mg/mL）混合，在37°C下孵育15分钟，记录通过OH从水杨酸转化而来的2，3-二羟基*********的特征吸收（510nm）。

将水杨酸（20 μL，10 mM）、FeSO4（20 微升，10 毫米M）、H2O2（20 μL，10 mM）和PBS（100 μL，pH~7.4）混合物作为抗HOR能力的空白（抗HOR能力：0%），而水杨酸（20 μL，10 mM）、FeSO4（20 μL，10 mM）、PBS（20 μL，pH ~ 7.4）和聚合物（100 μL，10 mg/mL）分别被定义为100%抗HOR能力。

聚合物对2，3-二羟基*********的抑制效率反映了聚合物的抗HOR能力，每个样品进行了五次并行测试。

抗索尔检测

将黄嘌呤（XAN，7μL，4.10mM）、黄嘌呤氧化酶（XOD，0μL，4.10u/mL）、硝基蓝四唑（NBT，0μL，05.10mM）和聚合物（0μL，24mg / mL）的PBS溶液（pH ~ 100.10）混合在96孔板中。

在37°C下孵育15分钟，记录由NBT转化产生的******腙的特征吸收（560 nm），这是由•O2−引起的，将XAN（10 μL，0.4 mM）、XOD（10 μL，0.05 u/mL）、NBT（10 μL，0.24 mM）和PBS（100 μL，pH ~ 7.4）的混合物作为空白（抗SOR能力：0%）。

而XAN（10 μL，0.4 mM）、PBS（10 μL，pH ~ 7.4）、NBT（10 μL，0.24 mM）和聚合物（100 μL，10 mg/mL）的混合物分别被定义为100%抗SOR能力，聚合物对******腙的抑制效率反映了聚合物的抗SOR能力。

抗GOR测定

把聚合物溶液（100 μL，10 mg/mL的PBS溶液，pH 7.4）加入到96孔板中，向每个聚合物溶液中加入GOR（100 μL，0.2 mg/mL乙醇溶液），将混合物在37°C下孵育30分钟，并记录吸光度值（450 nm）。

使用PBS溶液（100 μL，pH 7.4）作为空白（抗GOR能力：0%），而将聚合物（100 μL，10 mg/mL的PBS溶液，pH 7.4）与乙醇（100 μL）混合，分别定义为100%抗GOR能力，聚合物对GOR的抑制效果反映了其抗GOR能力。

细胞培养

L929细胞（来自小鼠的成纤维细胞系）在补充有1640%胎牛血清（FBS）和10%青霉素和链霉素的培养基中培养，然后将细胞在37°C的5%CO中孵育2.培养基每两天更换一次，以维持细胞的指数生长。

细胞毒性评估

通过CCK-1065测定评估P（X）（Y）、P（PEGMA）、氨磷汀和WR-929等不同样品对L8细胞的细胞毒性，将细胞（约5×104细胞/mL）接种在含有培养基（96 μL，100% FBS和10%青霉素和链霉素）的96孔板中。

细胞附着后，用PBS洗涤细胞并加入含有不同浓度样品的培养基，培养48小时后，用PBS洗涤细胞三次，然后在含有100% CCK-10溶液（8°C，37小时）的2 μL培养基中孵育。

细胞在培养基中的吸光度被定义为100%活力，而培养基（无细胞）的吸光度被定义为0%，数据以平均±SD（n = 10）的形式呈现，以说明不同样品对L929细胞的细胞毒性，细胞安全浓度定义为细胞活力保持在90%以上的样品浓度。

辐射防护能力的细胞实验

L929细胞（约5 × 104细胞/mL）在培养基中与P（2）（1）（10）（0）孵育50小时，然后暴露于X射线照射（Radsource，RS-80 pro），直到累积辐射剂量达到7Gy（6.2Gy/min），将细胞用P（1）（10）（48）（3mg/mL）的培养基培养3小时，并加入PBS-FDA-PI混合溶液（FDA：450μg/mL；PI：490μg/mL）。

通过荧光显微镜在515–560 nm和3–2 nm带通激发滤光片（I1和N）下同时观察活细胞和死细胞，其他聚合物和氨磷汀在其细胞安全浓度下进行了平行测试，培养基中的细胞仅用作空白。

对于CCK-8测定，使用CCK-8溶液代替PBS-FDA-PI混合溶液来定量评估细胞活力，流式细胞术分析，细胞暴露于X射线并在不同化合物的培养中孵育48小时，加入含有PI（10μg/mL）的PBS溶液，并使其在细胞中分散15分钟。

使用流式细胞术（BD Calibur）进行分析，并根据文献用门控策略41，培养基中的细胞和氨磷汀（0.3 mg/mL）分别用作空白和对照。

菌落形成测定

在24孔板中，将L929细胞（约100个细胞/孔）与P（2）（1）（10）（0mg/mL，在培养基中）孵育5.80小时，然后暴露于X射线照射直到累积辐射剂量达到7Gy（6.2Gy/min），把细胞在1°C和10%CO2中孵育48小时。

将这些细胞连续培养12天，使用多聚甲醛固定（H2O）20分钟（25°C），然后用0.2%结晶紫水溶液染色10分钟（25°C），最后用PBS洗涤两次。

菌落中包含50个或更多细胞的被记录为幸存者，数据以平均值±SD（n = 3）的形式存在，没有经过X射线照射的细胞集落数定义为100%，其他聚合物和氨磷汀在其细胞安全浓度下进行了平行测试，培养基中的细胞仅用作空白组。

通过汉驰反应和相关聚合物库制备单体库的HTP方法

市售单体2-（乙酰乙酰氧基）乙基******丙烯酸酯通过Hantzsch反应以HTP方式转化为含有不同1，4-DHP部分的单体。

使用九种醛（A（X））和五种1，3-环己二酮衍生物（B（Y））的不同组合，同时创建了45（9×5）Hantzsch单体（M（X）（Y））。

单体在简单沉淀后易于获得高产率（88–98%），作为一个典型的例子，1M（X）单体的H核磁共振（NMR）波谱如图所示，可以清楚地识别Hantzsch环中甲烷群的特征峰，4-DHP环中乙烯基和甲烷基团中质子之间的积分比（I6.08–5.93/我5.73–5.61/我4.96–3.79） 为 1 ： 1 ： 0.97–1.04，与理论值 （1 ： 1 ： 1） 一致。

当使用其他1，3-环己二酮衍生物时，也获得了类似的结果，这些结果表明，通过HTP Hantzsch反应可以轻松制备不同的Hantzsch单体，这些M（X）（Y）单体与市售聚（乙二醇）甲醚******丙烯酸酯（PEGMA，Mn： ~950 克摩尔−1）通过方便的自由基聚合以HTP方式获得水溶性共聚物。

所有聚合物的单体转化率都很高，和令人满意的分子量（Mn（GPC）：38，600–186，000 克摩尔−1，P（X）（1）作为典型示例，这些结果表明，M（X）（Y）中不同的1，4-DHP基团与自由基聚合相容。

值得注意的是，P（4）（Y）具有比其他聚合物更广泛的多分散指数（PDI）（3.56-9.23），这可能是由于P（4）（Y）中的N，N-二******苯胺部分，可能在聚合过程中产生自由基33,34.P（4）（Y）中的N，N-二******苯胺自由基可能将其他聚合物链连接起来，导致广泛的PDI。

第二轮筛选：选定聚合物的辐射防护能力的细胞实验

在生物体中，电离辐射会迅速产生许多ROS（活性氧物种），这些ROS会迅速生成可扩散的次级自由基，进而攻击DNA并引起DNA断裂，导致细胞和器官受损。

尽管许多天然抗氧化剂，如维生素和多酚，具有出色的自由基清除能力，但它们在辐射防护方面表现较差，可能是因为它们对快速生成的次级自由基的清除能力不佳。

因此，进行细胞实验来评估抗氧化剂作为辐射防护剂的能力是必要的，在这项研究中，选择小鼠成纤维细胞系L929作为模型细胞，用于测试六种特定聚合物的放射防护能力。

使用

使用氨磷汀（8.4 mg/mL）培养的细胞表现出更好的活力，并且只观察到少量死细胞（红点），这证实了氨磷汀具有出色的放射防护能力，然而，在10 mg/mL P的存在下，几乎所有细胞在致命的X射线辐射下存活，直接染色的结果与使用CCK-8测定获得的定量分析结果一致，以及菌落形成测定结果。

根据细胞在不同剂量的X射线辐射下的活力，氨磷汀（0.3 mg/mL）和P（2）（1）（10 mg/mL）的细胞剂量减少因子（DRFs）分别计算为3.7和15，用于分析暴露于80 Gy的X射线辐射后的细胞坏死和使用门控策略。

与使用其他聚合物（约为2.1-7.8%）和氨磷汀（约为30.4%）培养的细细胞相比，使用培养的细胞表现出最低水平的细胞坏死（约为21.9%），这一结果与仅在培养基中培养或使用P（2）（1）（10 mg/mL）培养48小时而不暴露于辐射的细胞的结果相似。

培养的细胞：约为9.1%），经过测试，WR-0（氨磷汀在体内的活性形式），对L929细胞的放射防护作用略弱于氨磷汀。

结论：

我们使用Hantzsch反应以HTP方式制备了45种单体，这些单体与PEGMA共聚，通过HTP自由基聚合产生45种水溶性聚合物，通过HTP测量根据不同的标准逐步筛选这些聚合物，最终获得生物相容性聚合物，可以有效保护细胞和斑马鱼胚胎免受致命剂量的X射线辐射。所开发的聚合物的保护效果优于氨磷汀，这突出了在聚合物化学中使用MCR和HTP技术来确定潜在应用的功能性聚合物的价值。

参考文献：

【1】辛格，《以特定伤害药物和监管批准状态为重点的辐射对策综述：第一部分》

【2】 加勒特-贝克尔曼，《辐射防护剂的发展趋势》

【3】侯赛尼米尔，《第一个选择性靶标和广谱辐射保护剂》

【4】克里格曼，《射诱导的正常组织损伤的放射保护剂和缓解剂》