酵母双杂交技术示意图 最基础的蛋白互作实验-酵母双杂交实验

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小伙伴们大家好，在实验中需要验证蛋白质之间的相互作用时，你首先想到的是哪个实验方法呢？脑海中有没有想到酵母双杂交这个经典的方法呢？

其实很多小伙伴都知道这个实验，但是好像不太清楚实验的具体原理和操作（小薇上学那会也是迷迷糊糊，似懂非懂的）。今天小薇就和大家掰开揉碎讲讲酵母双杂交。

首先来讲一下原理：基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子的结构往往由两个或两个以上可以分开的，功能上相互独立的结构域（domain）构成。以GAL4为例，它包含DNA结合功能域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，使下游基因得到转录。

了解了原理我们再来看看怎么将理论转化为实践吧。

首先将称为bait（诱饵）的蛋白（即已知蛋白）构建在BD载体中，并表达BD-bait融合蛋白；

将prey（猎物）蛋白（即待测蛋白）构建在AD载体上，表达AD-prey融合蛋白。

如果bait和prey之间没有相互作用，那么BD和AD就不能结合，下游的报告基因也就不能被激活。这里的报告基因可以是营养缺陷等基因(最后可以通过观察酵母是否生长来看是否存在互作)。

接下来举个简单的例子，以一篇文章来实际解读一下酵母双杂吧。

这篇文章做酵母双杂是为了筛选可能与暹罗炭疽菌CAP20蛋白相互作用的候选蛋白。

1. 构建诱饵质粒pGBKT7-Cap20并检测其自激活（Tip：pGBKT7是一种酵母表达载体，特别设计用于表达GAL4 DNA结合结构域（BD）与bait蛋白的融合蛋白。融合蛋白在ADH1启动子下高水平表达。为了促进体外转录，在pGBKT7的GAL4 DNA-BD的表位签之间引入T7启动子。携带pGBKT7的酵母转化效率较高）。具体方法是将Cap20的522 bp片段克隆到质粒pGBKT7的BamHI和PstI位点之间，产生pGBKT7-Cap20，通过酶消化确认并产生大约7.3 kb和0.5 kb的条带，这两条带就是质粒的长度和克隆片段的长度。)将正确的重组质粒pGBKT7-Cap20转化到酵母双杂交系统中。选择SD/-Trp平板上直径为2 mm的酵母菌落，并使用引物J-Cap20-F和J-Cap20-R进行菌落PCR。在1%琼脂糖凝胶珠上成功检测到0.5kb条带(即上面的522bp)，表明成功构建了含有诱饵蛋白CAP20的酵母。用重组质粒pGBKT7-Cap20（此质粒编码BD Cap20）和pGADT7（此质粒编码GAL4 AD,没有加猎物蛋白）成功转化的酵母只能在SD/-Trp/-Leu平板上生长（此平板是SD 两种缺陷氨基酸混合物，携带色氨酸和亮氨酸的酵母可以在平板上生长，而没有的话则不能生长），而不能在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生长（同上）。该结果表明，在没有猎物蛋白的情况下，含有pGBKT7-Cap20的质粒不能自主激活酵母中报告基因的表达。

2. 使用酵母交配筛选蛋白质CAP20的相互作用成分。培养诱饵菌株pGBKT7-Cap20。将交配的培养物在SD/-Trp/-Leu培养基上孵育用于初步筛选。然后将菌落移至选择性SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培养基，共获得102个蓝色酵母单菌落(X-α-Gal存在时，阳性克隆会变成蓝色)。筛选文库后，从所有阳性菌落中提取猎物质粒，并用pGBKT7-Cap20将其重新转化到Y187酵母中，并重新分析相互作用特征。获得24个阳性结果，从猎物中提取的相应质粒通过NCBI/BLASTx进行测序和分析。最终从102个阳性克隆中获得了16个不同的基因（图1）。在相应的蛋白质中，发现了cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基（PKAC1）、蛋白激酶、乙酸激酶、组氨酸酸性磷酸酶、铁还原酶样跨膜成分、疏水蛋白、糖蛋白、过敏反应诱导蛋白和一些假设蛋白。

这张图就是本篇文章的主要结果。其中：pGBKT7:P53 pGADT7:Rec-T为阳性对照；PGBKT7 PGADT7为阴性对照（从这个图我们就可以明显看出来，阳性对照和那16种阳性的猎物的培养皿中酵母生长良好，证明其存在相互作用，激活了下游的报告基因，而阴性对照和pGBKT Cap20 pGADT7则没有激活报告基因。）

Tip：pGBKT7:P53编码一种GAL4 DNA-BD和鼠源的p53融合蛋白，而pGADT7:Rec-T编码GAL4 AD的融合蛋白。

好啦，以上就是今天分享的内容，小伙伴们有没有看懂啊？正在准备标书的小伙伴们做技术路线设置的时候可以考虑一下这个实验哦~

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