芽孢形成的细菌是新细菌吗？坏死杆菌是一种无鞭毛芽孢的革兰阴性细菌

阅读文章前，辛苦您点下右上角的“关注”，方便您讨论分享，持续关注每日优质内容~

坏死杆菌（Fusobacteriumnecrophorum,F，necrophorum）是一种无鞭毛、无芽孢、严格厌氧的革兰阴性细菌，多以长杆状存在于自然界中。

坏死杆菌感染动物可造成反刍动物腐蹄病、犊牛白喉、牛肝脓肿、奶牛乳房炎和子宫内膜炎等疾病，并在宿主体内长期存在造成持续性感染。

坏死杆菌感染对肉牛和奶牛养殖业造成巨大经济损失。

多种证据表明，持续的微生物感染多是以生物被膜（Biofilm）形式存在的细菌所引起的。

生物被膜是细菌的一种特殊存在形式，由细菌和自身产生的胞外多糖、胞外DNA和胞外蛋白共同组成，常附着在生物或非生物载体表面。

生物被膜的存在为细菌生长提供稳定的环境，使细菌免受干燥、免疫系统攻击、原生动物摄取和抗菌剂等环境压力的影响。

生物被膜的形成主要包括细菌不可逆的表面黏附、细菌增殖与胞外基质的产生和细菌的分离三个连续阶段。

细菌的黏附因子在生物被膜形成过程中起着重要作用。

对具核梭杆菌使用黏附素RadD血清孵育后，显著减弱了生物被膜的形成。

使用外膜蛋白FomA疫苗接种后，显著降低了口腔生物被膜的形成。

43KOMP是坏死杆菌的一个重要外膜蛋白，由Sun等首次在坏死杆菌中鉴定发现。

随后的研究显示43KOMP与坏死杆菌黏附宿主细胞的能力有关，是坏死杆菌重要的黏附因子之一。

43KOMP在坏死杆菌生物被膜形成过程中是否发挥作用，尚未有人研究。

因此，通过对坏死杆菌亲本株A25和缺失株A25Δ43KOMP生物被膜成熟时间、生物被膜不可逆附着阶段菌量、生物被膜形态和对临床常见药物耐药性进行研究，确定43KOMP基因与生物被膜形成特性的关系。

坏死杆菌亲本株A25株购自美国ATCC(Fusobacteriumnecrophorum,Fnn亚种，ATCC25286），坏死杆菌43KOMP基因缺失株（A25Δ43KOMP）由黑龙江八一农垦大学兽医分子病理学实验室构建并保存。

主要试剂：苛养厌氧菌肉汤培养基（FAB）和脑心浸液肉汤培养基（BHI）购自山东托普生物工程有限公司；琼脂购自广州赛国生物科技有限公司；结晶紫、碘化丙啶（PI）和荧光素-伴刀豆凝集素标记物（ConA-FITC）购自上海Sigma-Aldrich贸易有限公司；甲砜霉素、氨苄青霉素、红霉素、诺氟沙星、盐酸林可霉素、四环素、磺胺嘧啶、庆大霉素、卡那霉素、安普霉素和氯霉素购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

主要仪器：厌氧培养箱（YQX-Ⅱ）购自上海龙跃仪器设备有限公司；分光光度计（T6新悦）购自北京普析通用仪器有限公司；酶标仪（Infinite200PRO）购自瑞士TECAN公司；荧光显微镜（INTENSILIGHTC-HGFI）购自株式会社尼康。

取出存放于-80℃冰箱的坏死杆菌A25与A25Δ43KOMP菌液，用接菌环蘸取菌液于FAB固体平板划线，在37℃厌氧环境下培养48h，挑取单菌落接种于5mLFAB培养基试管中（缺失株培养基中加入甲砜霉素），37℃厌氧培养，连续传菌至3代后用于后续试验。

取无菌12孔板，每孔加入2mL制备好的菌液（OD600nm=0，01），阴性对照为BHI培养基，每组重复4孔。

37℃厌氧培养后，移除孔内液体，用无菌PBS溶液洗3次；每孔加入1mL甲醇固定15min，无菌PBS溶液洗3次；待孔内干燥后，每孔加入1mL结晶紫溶液染色5min，无菌PBS溶液洗3次；待自然干燥后，每孔加入1mL95%乙醇溶液，静置30min后用酶标仪测OD570nm值。

取无菌12孔板，每孔加入2mL制备好的菌液（OD600nm=0，01），阴性对照为BHI培养基，每组重复4孔。

37℃厌氧培养，每24h更换BHI培养基。

分别在接种0，5、1、2、3、4和5d用无菌PBS溶液洗去浮游细菌，根据1，3，2节方法进行结晶紫染色并测量OD570nm值，根据OD570nm值绘制生物被膜生长曲线。

取无菌12孔板，每孔加入2mL制备好的菌液（OD600nm=0，01），阴性对照为BHI培养基，每组重复4孔。

37℃厌氧培养，每24h更换BHI培养基。

分别在接种6、12、18和24h用无菌PBS溶液洗去浮游细菌，每孔加入1mL2%戊二醛固定1，5h，无菌PBS溶液洗3次；每孔加入1mLPI避光染色15min，无菌PBS溶液冲洗3次，加入1mL40%甘油封顶后，通过荧光显微镜观察并随机选取3个视野进行拍照，对每个视野随机选取3个200μm2区域进行菌量计数。

取无菌12孔板，每孔加入2mL制备好的菌液（OD600nm=0，01），阴性对照为BHI培养基，每组重复4孔。

37℃厌氧培养，每24h更换BHI培养基。

分别在接种2、3和4d用无菌PBS溶液洗去浮游细菌，每孔加入1mL2%戊二醛固定1，5h，无菌PBS溶液洗3次；每孔加入1mLConA-FITC避光染色30min，无菌PBS溶液冲洗3次；每孔加入1mLPI避光染色15min，无菌PBS溶液冲洗3次，加入1mL40%甘油封顶后，通过荧光显微镜观察并拍照。

根据CLSI标准，通过肉汤微量稀释法检测坏死杆菌对10种抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。

取无菌96孔板，前10列作为试验组，第11列作为阳性对照，第12列作为阴性对照。

将待测药物配制为256μg·mL-1，加入第一孔，用BHI培养基进行连续倍比稀释。

试验组及阳性对照组每孔加入100μL坏死杆菌菌液（OD600nm=0，01），阴性对照组加入等体积BHI培养基，每组4个重复。

37℃厌氧培养24h后，观察细菌生长情况并记录结果。

所有的试验数据都以3次独立试验的平均值±标准方差（x±s）来表示，并在GraphPadPrism9中进行分析，分析中组间采用独立样本t检验（两组间分析）或多因素方差分析：one-wayANOVA或twowayANOVA（多组间分析），以*P≤0，05为差异显著，**P≤0，01为差异极显著。

为研究43KOMP基因缺失对坏死杆菌生物被膜成熟时间是否产生影响，对接种亲本株A25和缺失株A25Δ43KOMP所产生的生物被膜进行结晶紫染色，测定OD570nm值。

亲本株A25与缺失株A25Δ43KOMP生物被膜形成时间无显著差异，接种1d生物被膜无显著增长现象，接种2d开始形成生物被膜，接种4d生物被膜成熟。

坏死杆菌缺失43KOMP基因后，坏死杆菌成熟生物被膜含量显著升高。

由此可见，43KOMP基因缺失不影响坏死杆菌生物被膜成熟时间，但对生物被膜含量造成影响。

为研究缺失43KOMP基因对生物被膜不可逆附着阶段细菌附着数量的影响，根据生物被膜成熟时间选定接种24h以内为不可逆附着阶段，对接种6、12、18和24h生物被膜进行PI染色，荧光染料PI特异性与细菌DNA进行结合发出红色荧光，通过荧光显微镜对200μm2内细菌进行计数。

在接种6～18h，亲本株A25与缺失株A25Δ43KOMP含量均无显著差异，接种24h，缺失株A25Δ43KOMP细菌含量显著下降。

结果表明缺失43KOMP基因对坏死杆菌生物被膜形成早期的不可逆附着阶段有一定影响。

为研究43KOMP基因缺失对坏死杆菌生物被膜形态是否产生影响，用荧光染料ConA-FITC特异性结合生物被膜内胞外多糖并发出绿色荧光，用荧光染料PI复染特异性结合生物被膜内细菌DNA分子并发出红色荧光，在荧光显微镜下观察坏死杆菌亲本株A25和缺失株A25Δ43KOMP的生物被膜形态。

结果如图3所示，坏死杆菌亲本株A25和缺失株A25Δ43KOMP均检测到生物被膜的形成。

亲本株A25接种3d出现聚集性小菌落；缺失株A25Δ43KOMP接种2d出现聚集性菌落，接种4d出现沟壑状结构。

43KOMP基因的缺失对坏死杆菌生物被膜形态未产生影响，但对生物被膜菌落形成时间产生影响。

为研究43KOMP基因缺失对坏死杆菌耐药性的变化，检测亲本株A25和缺失株A25Δ43KOMP对10种抗菌药的MIC值。

结果如表2所示，缺失43KOMP基因后，坏死杆菌对磺胺嘧啶、庆大霉素、卡那霉素和安普霉素的耐药性减弱。

结果表明，缺失43KOMP基因对坏死杆菌耐药性产生影响。

检测生物被膜的方法有很多种，主要包括刚果红琼脂培养基法、结晶紫染色法、扫描电子显微镜法、激光共聚焦扫描显微镜法、质谱分析和PCR检测法。

研究采用结晶紫染色法对坏死杆菌生物被膜进行定量研究。

结果显示，坏死杆菌亲本株A25和缺失株A25Δ43KOMP接种2d开始形成生物被膜，接种4d生物被膜含量不再增加，生物被膜成熟。

缺失株A25Δ43KOMP所产生的生物被膜含量显著高于亲本株A25所产生的生物被膜含量。

由此可见，43KOMP基因在坏死杆菌生物被膜形成过程中起到一定作用。

在坂崎肠杆菌（Cronobactersakazakii）的研究中，坂崎肠杆菌在NaCl胁迫下缺失外膜蛋白OmpW的菌株形成的生物被膜含量显著高于亲本株，这可能是缺失突变株通过促进生物被膜的形成来适应NaCl胁迫。

43KOMP基因的缺失导致坏死杆菌对外界环境感知降低，从而增强生物被膜形成促进自身存活。

坏死杆菌43KOMP由Sun等首次发现，在后续研究中发现其能够介导坏死杆菌黏附宿主细胞。

利用重组43KOMP制备的血清与坏死杆菌共孵育后可抑制坏死杆菌与仓鼠肾细胞（BHK）细胞的结合。

2022年He等研究发现43KOMP可与纤连蛋白结合介导坏死杆菌与BHK细胞黏附。

43KOMP是坏死杆菌重要的黏附因子之一。

在生物被膜形成初期，细菌的黏附因子在不可逆附着阶段起重要作用。

在艰难梭菌生物被膜研究中，其表面蛋白及大分子如鞭毛、Ⅳ型菌毛和S层均参与生物被膜的形成。

在粪肠球菌黏附素ace基因的研究中，存在ace基因的肠球菌生物被膜平均厚度、细菌密度及活菌比例均高于无ace基因的肠球菌。

43KOMP基因的缺失导致接种24h坏死杆菌生物被膜含菌量显著降低，这说明43KOMP基因对生物被膜形成具有一定影响。

生物被膜的结构形态与细菌的菌种相关，小菌落是大多数生物被膜的基本单位，但是其结构因细菌种类而差异巨大。

在流动培养室相同条件下培养，恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）形成松散突出的小菌落，而假单胞菌（Pseudomonasknackmussii）则形成球形小菌落。

此外，当两种假单胞菌在生物膜中一起生长时，其菌落特征互不影响。

生物被膜形态结构不仅与细菌种类有关，也与细菌所处的环境有关。

Klausen等证明当铜绿假单胞菌用葡萄糖培养基培育时，所形成的生物被膜则为蘑菇状的小菌落，而在用柠檬酸盐培养基培育时，则形成平坦的生物被膜。

在研究中，通过荧光显微镜观察坏死杆菌亲本株A25和缺失株A25Δ43KOMP的生物被膜形态。

结果显示亲本株A25和缺失株A25Δ43KOMP均产生沟壑状生物被膜，缺失株A25Δ43KOMP的沟壑结构出现的更早。

生物被膜形成后期，生物被膜内形成部分通道，这些通道可输送营养物质和分布氧气并能去除废弃产物。

43KOMP基因的缺失使得坏死杆菌更早的出现沟壑结构，43KOMP基因可能介导坏死杆菌营养输送。

生物被膜的形成使得细菌的耐药性增加，其耐药性比游离细菌提高了甚至1000倍，给疾病治疗带来了严重的挑战。

研究中，缺失43KOMP基因使得坏死杆菌对庆大霉素、卡那霉素和安普霉素的耐药性减弱。

该三类药物均属于氨基糖苷类药物，主要用于治疗革兰阴性需氧菌、葡萄球菌和其他革兰阳性菌引起的感染，革兰阴性厌氧菌对氨基糖苷类药物具有一定耐药性。

氨基糖苷类抗生素耐药主要通过突变16SrRNA、******化16SrRNA、改变细胞膜通透性、外排泵泵出细胞内抗生素和低活性乙酰转移酶螯合抗生素。

有研究预测，坏死杆菌43KOMP结构更倾向于孔蛋白。

那么43KOMP在坏死杆菌外膜上是否调控细胞膜的通透性直接影响到坏死杆菌对营养摄取、胞外基质酶排出和药物排出等功能，43KOMP是否作为外排泵使得坏死杆菌对氨基糖苷类药物产生耐药，还需进一步研究，对43KOMP结构的揭示将有助于对43KOMP功能的研究。

因此，坏死杆菌43KOMP基因缺失促进坏死杆菌生物被膜的形成，抑制坏死杆菌对氨基糖苷类药物的耐药。